sábado, 12 de junio de 2010

TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN

1. INTRODUCCIÓN:

En esta última tarea se determinará la concentración de nuestro analito (paracetamol o ácido acetilsalicílico) en la muestra.


Se pueden emplear diversos métodos. Uno de ellos, como ya hemos introducido en la tarea anterior, es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que sirve tanto para separar e identificar los componentes de una muestra (desarrollado en el trabajo previo) como para cuantificarlos (lo cual se correspondería con esta tarea). Así, para determinar la cantidad presente de cada sustancia, se valoran las áreas bajo los picos del cromatograma o la altura de los mismos: sirven para determinar la cuantía de cada componente. El programa informático asociado al sistema HPLC ya nos da estos datos.

Sin embargo, dado que sobre el fundamento del HPLC ya hemos profundizado lo suficiente en trabajos anteriores, hemos decido centrarnos en otros tipos de técnicas de determinación: las técnicas espectroscópicas.


2. DESARROLLO DE LA TÉCNICA: ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Usaremos esta técnica debido a su sencillez instrumental y a su amplio rango de aplicación. Como se fundamenta en la absorción de radiación electromagnética por las moléculas de la muestra (siendo la cantidad absorbida proporcional a la concentración de las moléculas que se quieren determinar) debemos hacer que el paracetamol (o el ácido acetilsalicílico) se una a un colorante o bien que cause su activación de tal forma que éste, al absorber en el espectro visible, nos sirva para determinar la cantidad del analito.

Por ejemplo, podemos hacer que el paracetamol se una a un colorante azoico, como la bencidina. Los colorantes azoicos forman parte de una familia de sustancias orgánicas caracterizadas por la presencia del grupo azo (–N=N) como cromóforo, asociados a grupos auxocromo de tipo amino o hidroxilo. Para la bencidina podemos obtener buenos resultados usando una longitud de onda de 495 nm.

Una vez aclarados estos aspectos previos sobre el fundamento de la técnica, procedamos a su desarrollo:


2.1. Elaboración de la recta de calibrado:

Se puede definir calibración como el conjunto de operaciones que se establecen para obtener la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración o masas del conjunto de patrones de calibrado.

Para ello lo más usado es la curva de calibrado, para cuya elaboración se emplean cantidades perfectamente conocidas de analito (disoluciones patrón). En nuestro caso realizaremos, por ejemplo, una serie de disoluciones que contengan 0 mg/ml (el blanco), 3, 6, 9, 12 y 15 mg/ml de paracetamol, respectivamente. A cada disolución le agregaremos también el reactivo de color (no entraremos en detalle en la explicación de estos pasos).

A continuación leeremos en el espectrofotómetro cada una de las disoluciones de concentración conocida a una longitud de onda de 495 nm. Imaginemos que los datos obtenidos fueran los siguientes:



Haciendo la representación gráfica, se observa lo siguiente:


Se aprecia que la relación entre la concentración del analito y la absorbancia es lineal. Ante nuestra muestra problema (la muestra de concentración desconocida que queremos determinar), tras realizar la medida de su absorbancia, ésta se interpola en la recta de calibrado para obtener así la concentración del analito en esa muestra.

Además del método gráfico previamente explicado, también se puede hallar la ecuación de la recta. Para ello usaremos la técnica de regresión por mínimos cuadrados. La recta tendrá una ecuación genérica del tipo y = mx + b, siendo “y” la absorbancia y “x” la concentración del analito (en nuestro caso paracetamol). Para hallar la pendiente de la recta (“m”) usaremos la siguiente fórmula:



Siendo “n” el número de pares de valores. Si sustituimos:



Calculamos ahora el valor de la ordenada en el origen (“b”):


por lo que


Nuestra ecuación de la recta de calibrado sería, pues:



De esta forma, sabiendo la absorbancia de nuestra muestra problema y sustituyendo en la fórmula podremos saber la concentración de paracetamol en la muestra problema. Por ejemplo, si la absorbancia de la muestra cuya concentración de paracetamol desconocemos fuese de 0.236:



mg de paracetamol por ml (también se podría calcular interpolando en la gráfica, pero así es más exacto).


2.2.Determinación de algunos parámetros de calidad del método realizado:

Existen una serie de parámetros cuantitativos que son indicadores de la calidad de las metodologías analíticas. Nosotros hallaremos algunos de ellos:



A) Sensibilidad: expresa la respuesta del instrumento analítico para una concentración determinada de analito.

Un método analítico será más sensible cuanto mayor sea la variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada. Por ejemplo, en nuestro caso, si para 3 mg/ml de paracetamol la absorbancia fuese de 0.070 en vez de 0.052, ese otro método sería más sensible.

La sensibilidad viene dada por la pendiente de la curva de calibrado “m”, que en nuestro caso es igual a 0.0176. Cuanto mayor sea, más sensible será el método.



B) Límite de detección (yLOD): Es la mínima concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento analítico significativamente diferente de la señal del blanco.

Para determinarlo hay que hacer un total de 30 blancos: obtendríamos 30 señales de absorbancia para el blanco. Imaginemos que esas 30 señales fueron:

· 0.000 nos dio 24 veces
· 0.001 nos dio 5 veces
· 0.002 nos dio 1 vez

La fórmula que nos permite calcular el límite de detección es:

Por lo que si sustituímos:

yLOD = 0.00023 + 3·0.00049 = 0.0017

El resultado viene en forma de señal (absorbancia). Para obtener la concentración habrá que sustituir en la recta de calibrado:

0.0017 = 0.0176x – 0.0008

x = 0.142 mg/ml (esta es la mínima concentración de paracetamol que proporciona una señal en el instrumento analítico significativamente diferente a la señal del blanco).


C) Límite de cuantificación (yLOQ): Expresa la concentración del analito que puede determinarse con seguridad (la mínima concentración a partir de la cual podemos cuantificar). La fórmula que nos permite calcularlo es:

Al sustituir:

yLOQ = 0.00023 + 10·0.00049 = 0.00513


De nuevo, el resultado viene en forma de absorbancia. Para obtener la concentración habrá que sustituir en la recta de calibrado:


0.00513 = 0.0176x – 0.0008


x = 0.337 mg/ml (esta es la mínima concentración de paracetamol a partir de la cual podemos cuantificar con seguridad).

lunes, 24 de mayo de 2010

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

1) Introducción a las técnicas de separación:

En esta cuarta tarea partiremos de un preparado farmacéutico, nuestra muestra, a partir de la cual queremos obtener mediante técnicas de separación el analito (ácido acetilsalicílico o paracetamol). Recordemos que habíamos dejado nuestra muestra completamente diluída en agua tras un previo proceso de preparación de la muestra tratado en la tarea anterior.

Existen muchas técnicas de separación, empleando una u otra en función de cada caso particular (deberemos fijarnos en el estado de la muestra y en las propiedades específicas del analito). En nuestro caso, hemos escogido como técnica más adecuada la cromatografía. Esta elección se centra fundamentalmente en que se trata de uno de los métodos más utilizado en todas las áreas de la ciencia y que permite la separación e incluso la identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas. Además ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general, y es totalmente compatible con nuestra muestra.

2) Características generales de la cromatografía:

Todos los métodos cromatográficos tienen en común el uso de una fase estacionaria y una fase móvil. La muestra se desplaza con la fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie sólida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria se moverán con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

3) Tipos de métodos de separación cromatográfica y elección del que vamos a usar:

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de diferentes modos, entre los que destacamos dos de ellos:

- El primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto (la técnica cromatográfica usada), diferenciándose así la cromatografía en columna de la cromatografía en plano o plana. En nuestro caso hemos escogido la cromatografía en columna, donde un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión o gravedad.

- El segundo se centra en el tipo de fase móvil, diferenciando así la cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos (la cromatografía lleva el nombre de la fase móvil). Según esto, nosotros hemos escogido la cromatografía de líquidos, ya que la fase móvil es un líquido (nuestro analito está completamente diluido en agua). Además, esto lo podemos llevar a cabo perfectamente en columna.

Dentro de la cromatografía de líquidos se diferencian la cromatografía de reparto (líquido-líquido) y la de adosrción (líquido-sólido), ambas con múltiples aplicaciones, entre ellas la separación de los componentes de fármacos (antibióticos, sedantes y analgésicos, como en nuestro caso).

4) Desarrollo del método de separación: cromatografía liquida de alta resolución (HPLC):

Los métodos anteriormente explicados se pueden desarrollar con gran eficacia mediante un sistema HPLC: se utiliza un instrumento compuesto por un reservorio de la fase móvil, una bomba, un inyector, una columna de separación y un detector.

La muestra se hace pasar a través de la columna (con la fase estacionaria) mediante el bombeo de la fase móvil líquida (de ahí la necesidad de una bomba de alta presión que permita que el líquido fluya por la columna, evitando de esta forma el posible estancamiento causado por la fase estacionaria). La muestra se introduce en pequeños volúmenes gracias a la actuación del inyector (que introduce de forma automatizada cantidades específicas de la muestra) y llegará a la columna en donde se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria. El retardo es el tiempo de retención, único para cada sustancia (de ahí la base del estudio cualitativo: el tiempo de retención dependerá de la naturaleza de la sustancia, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil).

Si colocamos al final de la columna un detector que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido) se obtienen una serie de picos que representan un gráfico denominado cromatograma. Este gráfico es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo:

- La posición de los picos en el eje del tiempo sirve para identificar los componentes de la muestra (análisis cualitativo basado en el tiempo de retención: el tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector).

- Las áreas bajo los picos o la altura de los mismos proporcionan una medida cuantitativa: sirven para determinar la cantidad de cada componente (aunque de esto nos ocuparemos en la tarea 5).


Un tipo de HPLC que podremos usar en nuestro caso es el de fase normal, el cual separa las sustancias según su polaridad. Usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se utiliza cuando el analito es polar (como el paracetamol). El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito (aumenta la interacción entre el analito y la fase estacionaria).

Este método presenta gran sensibilidad, permite hacer determinaciones cuantitativas exactas, separar especies no volátiles y tiene gran aplicabilidad: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos (como en nuestro caso), plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas e inorgánicas.

Otro tipo de HPLC que también nos es válido es el de fase reversa, en donde la fase estacionaria es apolar y la fase móvil tiene polaridad moderada (caso contrario al anterior). En este tipo de cromatografía se utiliza una fase estacionaria hidrofóbica [como por ejemplo octadecilsilano químicamente unido a partículas porosas de sílice de 3 y 10 µm de diámetro: se suelen utilizar sustancias hidrofóbicas con grupos funcionales octadecilo (C – 18) u octilo (C – 8)] y una fase móvil polar, frecuentemente una fase móvil parcial o totalmente acuosa. Las sustancias polares prefieren la fase móvil y eluyen primero.


De esta forma se conseguirán separar los diferentes componentes de la muestra (paracetamol y excipientes, o bien ácido acetilsalicílico y excipientes). La interpretación de los distintos picos cromatográficos en base a su orden de aparición y tiempos de retención nos permitirá elaborar un estudio cualitativo.

Si el método usado fue el de fase normal, el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluír. En este caso A sería el menos polar y C el más polar.

Si el método usado fue el de fase reversa, el analito más polar será el primero que se eluye y el más apolar el último en eluír. En este caso C sería el más polar y A el más apolar.

El estudio cuantitativo del cromatograma se desarrollará en la próxima tarea.

sábado, 15 de mayo de 2010

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS

En esta tarea se han de determinar las etapas, por orden de realización, que se deberían utilizar para la preparación de la muestra (en nuestro caso se corresponde con un preparado farmacéutico con ácido acetilsalicílico o paracetamol como principios activos).

Recordemos que la realización del análisis está precedida por una serie de pasos muy elaborados, tanto o más que la medición en sí. Por lo general se distinguen los siguientes pasos:
  • Definir la problemática analítica (el objeto de estudio).
  • Realizar operaciones previas (toma de la muestra, preparación de la muestra, eliminación de interferencias, etc.).
  • Medición del analito (análisis en sí).
  • Cálculos (adquisición de datos).
  • Análisis e interpretación de los resultados.

El punto que trataremos sobre estas líneas se corresponde con la preparación de la muestra. Al igual que nos ocurrió en trabajos anteriores, nos encontramos con el problema de que se nos asignó una muestra genérica: cualquier fármaco que contenga los analitos previamente citados, lo cual implica no sólo que los excipientes que nos podamos encontrar (y por lo tanto las muestras) sean muy variables en función al laboratorio que las comercialice, sino que en función a cómo se presenten (comprimidos, supositorios, en suspensión líquida…) el procedimiento de preparación de la muestra podrá ser diferente.

Es por esto por lo que hemos decidido partir de una muestra sólida, como por ejemplo un comprimido masticable de Termalgin 500 mg, en
donde además de paracetamol como principio activo nos encontramos con una serie de excipientes: talco, povidona, almidón de maíz, almidón de maíz pregelatinizado, sílice coloidal anhidra, celulosa microcristalina y ácido esteárico.

Una vez seleccionado el objeto que se va a estudiar, hemos de caracterizarlo para saber cómo lo debemos tratar para su análisis. Aunque podríamos pensar que se trata de una mezcla homogénea (ya que la industria farmacéutica homogeniza muy bien la mezcla para separar la dosis exacta en cada comprimido) es difícil que lo sea ya que en el proceso de compresión se suele diferenciar esa mezcla. Concluimos, pues, que estamos ante un objeto heterogéneo cuyas propiedades van cambiando de forma discreta a través del mismo (esto es lo que ocurre en la mayoría de objetos a analizar en problemáticas analíticas reales).


Partiendo del objeto se ha de seleccionar la muestra, la cual ha de presentar una serie de características:

- Representar fielmente las propiedades del objeto.
- Presentar un tamaño manejable.
- Conservar sus propiedades durante el transporte y análisis.
- Transmitir la información requerida para resolver el problema.
- Mantener las mismas propiedades del objeto en el momento del muestreo.

En nuestro caso, el propio objeto en su totalidad (es decir, un comprimido de Termalgin 500 mg) cumple todas esas características, por lo que ya lo podríamos considerar como nuestra muestra bruta. El siguiente paso consistiría en obtener la muestra de laboratorio por reducción directa de la muestra bruta, para lo cual estarían implicadas una serie de prácticas previas al trabajo en el laboratorio. Sin embargo, como el tamaño que presenta ya es totalmente manejable (permite analizar al objeto en su totalidad) ya lo podríamos considerar como nuestra muestra de laboratorio. De esta forma conseguimos evitar una serie de pasos previos al laboratorio que sí serían necesarios en el caso de otras muestras, pero no en el caso de la nuestra:

- Reducir el tamaño de la muestra mediante diferentes mecanismos. En nuestro caso la muestra ya presenta un tamaño totalmente manejable, por lo que prescindiremos de este paso.

- Mezclar las partículas de la muestra: a más cantidad de la muestra a considerar, menos error. En nuestro caso, como la muestra es el objeto en su totalidad, este paso tampoco sería necesario y además apenas cometeríamos error ya que podremos hacer el análisis de todo el contenido del fármaco, es decir, de todo el objeto.

Una vez señaladas dichas aclaraciones sobre el trabajo previo al laboratorio podemos pasar ya al trabajo en laboratorio en sí. Habrá que tener en cuenta que el tratamiento de la muestra dependerá de diversos factores, entre ellos:

  • Su estado físico (en nuestro caso sólido).
  • El tipo de matriz (en nuestro caso es un componente orgánico sintético).
  • El tipo de analito y su concentración (en nuestro caso tenemos 500 mg de paracetamol en la muestra, por lo que se trataría de un componente macro).

Otro aspecto importante a tener en cuenta es que en todos los pasos se deben evitar errores sistemáticos (de laboratorio) que originarían una variación en la composición química de la muestra, tales como:

  • La contaminación de la muestra (es decir, que caiga en la muestra alguna sustancia que no tenía).
  • La pérdida de analitos (por ejemplo, si hay que hacer algún trasvase, que no queden gotas por el camino, etc.).

Veamos, pues, cuáles serían los pasos que tendríamos que llevar a cabo para el procesado de nuestra muestra en el laboratorio:

1) PULVERIZACIÓN:

Los sólidos pueden pulverizarse con un mortero, cuyo material dependerá de la dureza de la muestra a pulverizar. En nuestro caso podemos prescindir de un previo paso de trituración con molino de discos o de bolas ya que nuestra muestra es pequeña y de poca dureza con lo que es suficiente con el uso del mortero, el cual podrá ser de porcelana o vidrio (si la muestra fuese dura, como muchos minerales, podríamos usar un mortero de acero o ágata).

Al pulverizar conseguimos reducir el tamaño de partícula, de tal forma que al poseer mayor área superficial se disolverá mejor.

Habrá que tener especial cuidado de evitar contaminaciones que puedan ser responsables de la aparición de errores de tipo sistemático: los morteros más económicos tienden a ser más porosos y a rayarse con mayor facilidad, lo cual podría provocar contaminación de la muestra con el material del mortero.

2) HOMOGENEIZACIÓN:

Una vez pulverizada la muestra será necesario homogeneizar el polvo obtenido. Para ello simplemente lo hacemos rodar sobre una hoja de papel satinado (muy liso y resbaladizo).

Dado que es fácil de obtener mediante el uso del mortero el fármaco totalmente desmenuzado en un polvo fino y homogéneo, podemos prescindir del proceso de tamizado.

3) CONSERVACIÓN:

Es probable que se desee conservar la muestra si no se quiere analizar de forma inmediata. Entonces, para evitar que se produzca su degradación o la pérdida del analito, se deberá almacenar y etiquetar en las condiciones más favorables y en contenedores adecuados (si no es así, debido a factores físicos como la temperatura, la exposición a la luz o la naturaleza del contenedor se podrían producir cambios en la muestra que alterarían los resultados).

De igual modo, para garantizar una mínima variabilidad de los componentes de la muestra al mismo tiempo que se protege de la degradación se debe almacenar en un contenedor que no contamine a la muestra ni adsorba analitos en sus paredes. La elección del material del contenedor dependerá del tipo de muestra: en nuestro caso, como se trata de una muestra orgánica (aunque sintética) se usarán preferentemente contenedores que no sean de plástico (ya que éstos también son de naturaleza orgánica y podría haber interferencias) como frascos de cerámica: cuarzo, cristal, porcelana…

4) SECADO:

Antes del análisis, los sólidos suelen secarse a 110ºC a presión atmosférica a fin de eliminar el agua adsorbida. Además, en el caso de que se quisiera almacenar, las muestras secas se conservan mejor.

Por otra parte, en el caso de querer analizarla, la muestra de análisis debe tener una composición constante con respecto a la humedad que la impregna ya que ésta puede afectar a operaciones posteriores. Al mismo tiempo, los resultados suelen expresarse en función del peso seco de la muestra.

Para secar nuestro homogeneizado en polvo de comprimido de paracetamol podríamos usar una estufa a unas temperaturas sobre los 100ºC. El secado se considerará completo cuando el peso de la muestra sea constante.

La utilización de liofilizadores no sería necesaria en este caso ya que no existe riesgo elevado de descomposición o pérdida del analito a esas temperaturas.

Una vez seca, la muestra debe guardarse en un desecador para que no vuelva a adsorber humedad. Los desecadores contienen en su interior un desecante, como la sílica gel, que adsorbe todo el agua. En función al color que tome el desecante sabremos que se ha captado más o menos agua (cuando se hidrata la sílica gel se vuelve de color rosa y para que siga funcionando habrá que quitarle el agua: la ponemos en una estufa hasta que pierda la humedad, lo cual es fácil de saber ya que se vuelve de color azul).


5) PESADO:

Habrá que saber la cantidad de muestra que se va a analizar para posteriormente ser capaces de hacer bien los cálculos. Para ello usaremos una balanza y, en función a la precisión que requiera nuestro análisis, ésta podrá ser:

· De tipo granataria: precisión hasta la centésima o milésima de gramo (para pesos aproximados).

· Balanza analítica: como mínimo una precisión de décimas de miligramo. Sería mejor usar este tipo de balanzas ya que es más precisa (incluso están cerradas mediante vidrios para que no afecten las corrientes de aire).

Usemos la balanza que usemos la pesada podrá ser directa (por adición: se añade la cantidad en la balanza y se lee el resultado) o indirecta mediante el método por diferencia (primero pesamos el contenido total, luego le sacamos a éste la cantidad con la que vamos a trabajar y luego pesamos lo que queda: habrá que calcular la diferencia). De todas formas, en nuestro caso podemos pesar la muestra pulverizada entera (es decir, el comprimido entero) de tal forma que usaremos la pesada directa.

6) DISOLUCIÓN:

Una vez hechos todos los pasos anteriores, sólo nos queda disolver la muestra para el análisis de los constituyentes deseados (en la mayoría de los procedimientos analíticos la medida del analito en una muestra se realiza vía disolución). Es importante disolver toda la muestra o de lo contrario existirá la duda de si se disolvió todo el analito de interés.

En función a la naturaleza de la muestra y al tratamiento al que va a ser sometida posteriormente se usarán distintos métodos para disolverla. El disolvente no debe adicionar ningún componente que luego modifique el análisis y además debe disolver a la muestra completamente.

En nuestro caso podremos disolver la muestra por vía húmeda usando agua como disolvente (la solubilidad del paracetamol en agua es de 1,4 g/100 ml a 20°C). Al usar agua, no se llevarán a cabo reacciones químicas. El hecho de emplear agua presenta una serie de ventajas:

-No se suelen producir pérdidas del analito.
-No se producen ataques en las paredes del recipiente donde se produce la disolución.
-No existen riesgos para el analista.

Si por ejemplo en vez de considerar un comprimido de paracetamol consideráramos una aspirina efervescente, bastaría con introducir ésta en agua a temperatura ambiente gracias a las propiedades de la muestra.

Se deben evitar otros métodos de disolución que puedan destruir la materia orgánica ya que nuestro analito presenta esa misma naturaleza.

Para llevar a cabo la disolución basta con añadir la muestra a un volumen determinado de agua en un vaso de precipitados u otro recipiente de laboratorio similar y agitar para facilitar el proceso. No hace falta usar recipientes cerrados ya que la pérdida del analito es nula (el punto de ebullición del paracetamol es superior a los 500°C).



sábado, 24 de abril de 2010

VALIDACIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Y PARACETAMOL EN PREPARADOS FARMACÉUTICOS

1. INTRODUCCIÓN:

La validación analítica consiste en comprobar que los procedimientos e instrumentos utilizados en los análisis son seguros y fiables. Si los métodos analíticos no se validaran podrían producirse valores falsos que comprometerían la calidad de los mismos.

En el desarrollo de un método de validación analítica es necesario considerar diferentes parámetros tales como la precisión (es decir, la determinación sobre múltiples muestras del mismo parámetro varias veces, comprobando la coincidencia entre sí) o la exactitud (es decir, la comparación del resultado aceptado o real de la muestra con el obtenido en el resultado analítico o con la media de un conjunto de resultados).

A continuación se hablará de diferentes métodos y materiales que se pueden utilizar en el proceso de validación de la determinación de ácido acetilsalicílico y paracetamol en preparados farmacéuticos, seguido de un ejemplo en el que se calcula la exactitud y precisión de la determinación de uno de esos analitos (paracetamol) en una muestra concreta.

2. MÉTODO PARA LA VALIDACIÓN DE ÁCIDO ACETILSALICÍLICO EN PREPARADOS FARMACÉUTICOS:

2.1. INTRODUCCIÓN:

Para realizar la determinación de un analito en una muestra se emplea un método oficial de análisis. En nuestro caso queremos determinar la presencia de ácido acetilsalicílico en preparados farmacéuticos y para ello utilizaremos un método de tipo experimental denominado Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o High Performance Liquid Chromatography (HPLC), una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

2.2. CROMATROGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC):

La HPLC es un tipo de cromatografía en columna muy utilizado en bioquímica y química analítica para la separación y análisis cuantitativo de una amplia variedad de mezclas, especialmente aquellas en las cuales sus componentes no son volátiles o son térmicamente inestables para ser separados por cromatografía de gases o en capa fina dado que esta técnica evita el contacto con el aire y la luz.

El compuesto se hace pasar por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente un cilindro con pequeñas partículas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de un líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna (lo cual permite que los compuestos avancen más rápidamente a través de la columna acelerando el proceso). Los componentes de la muestra a analizar se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones con la fase estacionaria a medida que atraviesan la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, así como de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil.

El objetivo es la separación y determinación cuantitativa del ácido acetilsalicílico en nuestra muestra (fármaco analgésico) a través de un calibrado con patrones. Los datos cromatográficos serán procesados por un ordenador que contiene un programa de integración.

· MATERIAL:

El material de laboratorio necesario para este análisis incluye los siguientes aparatos o instrumentos:

- Cromatográfo de líquidos de alta eficacia Perkin Elmer con detector UV-visible

- Columna cromatográfica C18 de 15 cm de longitud, 4.0 mm de diámetro interno y 5 μm de tamaño de partícula.

- Filtros para disolventes de 0.40 μm.
- 8 matraces aforados de 10 mL.
- 2 matraces aforados de 100 mL.
- 1 matraz aforado de 500 mL.
- 1 matraz aforado de 1000 mL.
- Pipeta graduada de 10 mL.
- Pipeta graduada de 5 mL.

· REACTIVOS Y DISOLUCIONES:

Los reactivos que requerimos son ácido acetilsalicílico (sólido), metanol, ácido fosfórico y agua destilada. Con estos reactivos preparamos las siguientes disoluciones:

-Disolución de 500 mg/L de ácido acetilsalicílico. Para ello pesamos una cantidad adecuada del analito para preparar 100 mL de disolución y la disolvemos en metanol.

-Fase móvil: mezcla de metanol/agua/ácido fosfórico formada por 40% de metanol, 59.92% de agua y 0.08% de ácido fosfórico.

· PROCEDIMIENTO:

En primer lugar, para la obtención del calibrado, se preparan disoluciones patrón que contengan entre 20 y 100 μg/mL de aspirina en la fase móvil. Se fija la longitud de onda de detección en 254 nm y el caudal en 1.0 mL/min.
Una vez obtenidas las disoluciones del analito con la fase móvil se inyectan en el cromatógrafo de líquidos las mezclas preparadas y se registran las áreas resultantes. Con esos datos se construye una curva de calibrado en la cual enfrentamos las áreas de los picos cromatográficos con la concentración correspondiente en cada caso. Esta curva se puede representar a través de programas informáticos del tipo hoja de cálculo, donde además se calculan las ecuaciones automáticamente.

· RESULTADOS:

Finalmente, concluiremos nuestro estudio con la determinación de la concentración de ácido acetilsalicílico en la muestra de preparado farmacéutico. Para ello se inyectan 20 μl de muestra tres veces y se cuantifican los picos correspondientes a aspirina a partir de la curva de calibrado obtenida en el apartado anterior. El resultado se expresa como μg de aspirina por mL de muestra.

Necesitaremos las ecuaciones de la curva de calibrado y el cálculo de la regresión lineal o calidad de ajuste, así como también el cálculo del intervalo de confianza y precisión.

3. MÉTODO PARA LA VALIDACIÓN DE PARACETAMOL EN PREPARADOS FARMACÉUTICOS:

3.1. INTRODUCCIÓN:

La Food and Drug Administration (FDA) establece la espectrofotometría UV como método de referencia para la cuantificación de paracetamol. Esta técnica es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. La espectrofotometría UV usa haces de radiación del espectro electromagnético en el rango UV de 80 a 400 nm (principalmente de 200 a 400 nm) y en el de la luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

En este trabajo vamos a validar el método conductimétrico (basado en la diferente conductividad del sistema a distintos intervalos de tiempo debido a las diferentes concentraciones de solutos) teniendo en cuenta el método de referencia para la validación de calidad del paracetamol, valorando su exactitud, rapidez, precisión… en el análisis.

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS:

· Materia Prima:

- Paracetamol principio activo, Lote Nº0220436, origen Dinamarca.

- Comprimidos de paracetamol 500 mg, Lote Nº018, preparado por PLAMECOR.

· Reactivos:

- Soluciones estándar de NaOH 0.130N y 0.036N.

- Hidróxido de amonio concentrado (26% p/p) p.a.

· Equipos:

- Conductímetro Digital Pársec. Rango de lectura: 0,1 - 2 .105 μS. Exactitud: 0,5%.

- Celda de titulación de vidrio con encamisado p/ termostatización. Volumen útil: 150 mL.

- Agitador magnético.

- Bureta de 25 mL con llave de teflón.

- Balanza analítica.

3.3. PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO CONDUCTIMÉTRICO:

Se estandariza el conductímetro utilizando distintas masas de la droga base llevándolas a un volumen final de 150 ml con agua destilada. Para los análisis se parte, en cada caso, de una solución homogénea preparada a partir de 1 comprimido de paracetamol en 500 ml de agua destilada. Una alícuota de 150 mL, teóricamente
equivalentes a 150 mg de paracetamol, se transfiere al vaso de valoración y se adiciona un volumen dado de amoníaco. Una vez sumergidos los electrodos y la barra magnética se conecta el conductímetro. Se registra la conductancia después de cada agregado del valorante (NaOH). Graficando el volumen de NaOH (mL) con respecto a la conductancia (L, en μs) se localiza el punto final y se determina la masa de paracetamol presente en la muestra.

Como conclusiones del método conductimétrico:

- Es lineal en el rango de 50 a 300 mg de paracetamol (es decir, puede dar lugar a resultados proporcionales a la concentración del analito en la muestra).

- Su precisión y exactitud son comparables con las del método de referencia (Espectrofotométrico UV).

- Es simple y utiliza un equipo de bajo costo.

- Aplicable para el análisis de rutina de formulaciones farmacéuticas sin interferencias de los excipientes comunes.

- Es rápido y fácilmente automatizable.

4. CÁLCULO DE LA PRECISIÓN Y EXACTITUD DE LA DETERMINACIÓN DE PARACETAMOL EN COMPRIMIDOS DE 500mg MEDIANTE EL MÉTODO CONDUCTIMÉTRICO:

Tomando estos datos como referencia:

· PRECISIÓN: comparación de varianzas mediante un test F de dos colas.

Podemos aceptar con un 95% de probabilidad que las varianzas del método de referencia (espectrometría UV) y del método a evaluar (conductimetría) son comparables. Como sabemos que las varianzas son comparables y como el método de referencia es preciso afirmamos que el método a evaluar (conductimetría) también es PRECISO.

· EXACTITUD: comparación de medias.

Como las varianzas son comparables hacemos una varianza conjunta.

Podemos afirmar con un 95% de probabilidad que el método a evaluar (conductimetría) es EXACTO porque damos por hecho que el método de referencia (espectrometría UV) lo es.