TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

1) Introducción a las técnicas de separación:

En esta cuarta tarea partiremos de un preparado farmacéutico, nuestra muestra, a partir de la cual queremos obtener mediante técnicas de separación el analito (ácido acetilsalicílico o paracetamol). Recordemos que habíamos dejado nuestra muestra completamente diluída en agua tras un previo proceso de preparación de la muestra tratado en la tarea anterior.

Existen muchas técnicas de separación, empleando una u otra en función de cada caso particular (deberemos fijarnos en el estado de la muestra y en las propiedades específicas del analito). En nuestro caso, hemos escogido como técnica más adecuada la cromatografía. Esta elección se centra fundamentalmente en que se trata de uno de los métodos más utilizado en todas las áreas de la ciencia y que permite la separación e incluso la identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas. Además ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general, y es totalmente compatible con nuestra muestra.

2) Características generales de la cromatografía:

Todos los métodos cromatográficos tienen en común el uso de una fase estacionaria y una fase móvil. La muestra se desplaza con la fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie sólida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria se moverán con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

3) Tipos de métodos de separación cromatográfica y elección del que vamos a usar:

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de diferentes modos, entre los que destacamos dos de ellos:

- El primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto (la técnica cromatográfica usada), diferenciándose así la cromatografía en columna de la cromatografía en plano o plana. En nuestro caso hemos escogido la cromatografía en columna, donde un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión o gravedad.

- El segundo se centra en el tipo de fase móvil, diferenciando así la cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos (la cromatografía lleva el nombre de la fase móvil). Según esto, nosotros hemos escogido la cromatografía de líquidos, ya que la fase móvil es un líquido (nuestro analito está completamente diluido en agua). Además, esto lo podemos llevar a cabo perfectamente en columna.

Dentro de la cromatografía de líquidos se diferencian la cromatografía de reparto (líquido-líquido) y la de adosrción (líquido-sólido), ambas con múltiples aplicaciones, entre ellas la separación de los componentes de fármacos (antibióticos, sedantes y analgésicos, como en nuestro caso).

4) Desarrollo del método de separación: cromatografía liquida de alta resolución (HPLC):

Los métodos anteriormente explicados se pueden desarrollar con gran eficacia mediante un sistema HPLC: se utiliza un instrumento compuesto por un reservorio de la fase móvil, una bomba, un inyector, una columna de separación y un detector.

La muestra se hace pasar a través de la columna (con la fase estacionaria) mediante el bombeo de la fase móvil líquida (de ahí la necesidad de una bomba de alta presión que permita que el líquido fluya por la columna, evitando de esta forma el posible estancamiento causado por la fase estacionaria). La muestra se introduce en pequeños volúmenes gracias a la actuación del inyector (que introduce de forma automatizada cantidades específicas de la muestra) y llegará a la columna en donde se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria. El retardo es el tiempo de retención, único para cada sustancia (de ahí la base del estudio cualitativo: el tiempo de retención dependerá de la naturaleza de la sustancia, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil).

Si colocamos al final de la columna un detector que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido) se obtienen una serie de picos que representan un gráfico denominado cromatograma. Este gráfico es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo:

- La posición de los picos en el eje del tiempo sirve para identificar los componentes de la muestra (análisis cualitativo basado en el tiempo de retención: el tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector).

- Las áreas bajo los picos o la altura de los mismos proporcionan una medida cuantitativa: sirven para determinar la cantidad de cada componente (aunque de esto nos ocuparemos en la tarea 5).

Un tipo de HPLC que podremos usar en nuestro caso es el de fase normal, el cual separa las sustancias según su polaridad. Usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se utiliza cuando el analito es polar (como el paracetamol). El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito (aumenta la interacción entre el analito y la fase estacionaria).

Este método presenta gran sensibilidad, permite hacer determinaciones cuantitativas exactas, separar especies no volátiles y tiene gran aplicabilidad: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos (como en nuestro caso), plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas e inorgánicas.

Otro tipo de HPLC que también nos es válido es el de fase reversa, en donde la fase estacionaria es apolar y la fase móvil tiene polaridad moderada (caso contrario al anterior). En este tipo de cromatografía se utiliza una fase estacionaria hidrofóbica [como por ejemplo octadecilsilano químicamente unido a partículas porosas de sílice de 3 y 10 µm de diámetro: se suelen utilizar sustancias hidrofóbicas con grupos funcionales octadecilo (C – 18) u octilo (C – 8)] y una fase móvil polar, frecuentemente una fase móvil parcial o totalmente acuosa. Las sustancias polares prefieren la fase móvil y eluyen primero.

De esta forma se conseguirán separar los diferentes componentes de la muestra (paracetamol y excipientes, o bien ácido acetilsalicílico y excipientes). La interpretación de los distintos picos cromatográficos en base a su orden de aparición y tiempos de retención nos permitirá elaborar un estudio cualitativo.

Si el método usado fue el de fase normal, el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluír. En este caso A sería el menos polar y C el más polar.

Si el método usado fue el de fase reversa, el analito más polar será el primero que se eluye y el más apolar el último en eluír. En este caso C sería el más polar y A el más apolar.

El estudio cuantitativo del cromatograma se desarrollará en la próxima tarea.